磷脂酶D(EC₃.1.4.4)即磷脂酰胆碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与胞脂质代谢、信号转导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。

磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在500nm处有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

提取液：液体50ml×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体55ml×1瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体8ml×1瓶，4℃避光保存。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加3ml无水乙醇醇充分溶解。

试剂四：液体35ml×1瓶，4℃避光保存。标准品：液体1ml×1支，4℃避光保存。

需自备的仪器和用品：

天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计、1ml玻璃比色皿、恒温水浴锅，无水乙醇。

操作步骤：

一、酶液提取

1.组织：按照质量(g)：提取液体积(ml)为1：5-10的比例(建议称取约0.1g，加入1ml提取液)加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃，100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1ml试剂一。

2.细胞：按照细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500-1000：1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液)，冰浴超声波破碎细胞，功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min)；然后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1ml试剂一。

3.血清：直接测定。

二、测定操作

三、酶活计算公式

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位(U)。

PLD活性(U/mg prot)= A测定管/A标准管×C标准÷Cpr÷T= 0.017 ×(A测定管/A标准管)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位(U)。

PLD活性(U/g)= A测定管/A标准管×C标准÷W÷T= 0.017 ×(A测定管/A标准管)÷W

3.按照细胞数量计算

酶活性定义：每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位(U)。

PLD活性(U/10⁴cell)= A测定管/A标准管×C标准÷细胞数量÷T= 0.017 ×(A测定管/A标准管)÷细胞数量

4.按照样本质量计算

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量一个酶活力单位(U)。

PLD活性(U/ml)= A测定管/A标准管×C标准÷T= 0.017 ×(A测定管/A标准管)

C标准：标准品浓度，500nmol/L； Cpr：样品蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g/ml；T：反应时间，30min。

注意事项：

1.试剂三置于-20℃保存，临用前配制，配置好的试剂三置于4℃保存不超过7天。

2.显色完成后，若有沉淀，于8000rpm，25℃离心5min后取上清测定。

3.吸光值不宜超过 1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在算公式中乘以稀释倍数。