纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖一类酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系。以不溶性纤维素如滤纸为底物测定的纤维素酶称为滤纸酶，研究滤纸酶活力对纤维素酶总体酶活力的研究的有着重要意义。

FPA水解滤纸产生还原糖，还原糖与3,5 -二硝基水杨酸反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定540nm处吸光值变化可计算得FPA活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.滤纸条：常温防潮保存。

2.标准品：临用前加入1ml蒸馏水溶解，配成10mg/ml葡萄糖溶液备用，4℃可保存一周。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管(2ml)

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)：

1.组织：按照质量(g)：蒸馏水体积(ml)为1：5～10的比例(建议称取约0.1g，加入1ml蒸馏水)加入蒸馏水，冰浴匀浆后于4℃，12000rpm离心10min，取上清置于冰上待测。

2.细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管中，离心后弃上清；按照细胞或细菌数量(104个)﹕蒸馏水体积(ml)为500～1000﹕1的比例(建议500万细胞或细菌加入1ml蒸馏水)，冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率300 w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min)；然后4℃，12000 rpm离心10min，取上清置于冰上待测。

3.培养液或其它液体：直接检测。

二、测定操作：

1.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2.将10mg/ml标准液用蒸馏水稀释为1、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2mg/ml的标准溶液备用。

3.取100μL样本沸水浴10min(盖紧，防止水分散失)，放置常温后作为对照管。

4.操作表：(在2ml离心管中操作，其中对照管与测定管用有滤纸的EP管，空白管与标准管无需滤纸)

三、FPA活性计算

1.标准曲线的绘制：以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程

y=kx+b，将ΔA带入方程得到x(mg/ml)。

2.FPA活性的计算：

(1)按蛋白浓度计算

酶活定义：每mg蛋白每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。

FPA酶活(U/mg prot)=x×V提取÷(V提取×Cpr)÷T=0.0333x÷Cpr

(2)按样本质量计算

酶活定义：每g样品每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。

FPA酶活(U/g质量)=x×V提取÷W÷T=0.0333x÷W

(3)按照细胞或细菌数量计算

酶活定义：每104个细胞每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。

FPA酶活(U/10⁴ cell)=x×V提取÷细胞数量(万个)÷T=0.0333x÷细胞数量(万个)

(4)按液体体积计算

酶活定义：每ml样本每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。

FPA酶活(U/ml)= x×V样÷V样÷T =0.0333x

V提取：提取液(蒸馏水)体积，1ml；V样：加入的样本体积，0.1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，30min。

注意事项：

1.用干净的镊子取出滤纸条，带手套将滤纸条卷成小卷放入Ep管底部。

2.当A或ΔA超过1.2时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。

3.显色结束吸取检测液时注意枪头不要碰到滤纸条，以免带入毛状物，影响测定结果。