TrxR是一种NADpH依赖的包含FAD结构域的二聚体硒酶，属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员，与硫氧还蛋白以及NADpH共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR与GR活性类似，催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。

TrxR催化NADpH还原DTNB生成TNB和NADP+，TNB在412nm有特征吸收峰，但还原型谷胱甘肽与DTNB同样能反应生成TNB，因此本试剂盒利用2-乙烯吡啶抑制样本中原有的还原型谷胱甘肽，通过测定412nm波长处 TNB的增加速率，即可计算TrxR活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂三：临用前取1支加入1.667ml蒸馏水溶解，用不完的试剂-20℃保存1周。

2.试剂四：临用前根据样本数量将试剂四用无水乙醇稀释10倍后使用。

需自备的仪器和用品：

低温离心机、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、蒸馏水、无水乙醇。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1.组织：按照组织质量(g)：试剂一体积(ml)为  1：5～10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml试剂一)进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待检测。

2.细菌、细胞：按照细胞数量(104个)：试剂一体积(ml)为500～1000：1的比例(建议500万细胞加入1ml试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min)，然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。注：测定前将上清液与试剂四以50：1的体积比混匀(即取100μL上清液加入2μL试剂四混合)37℃水浴30min后至冰上。

二、测定操作

1.分光光度计或酶标仪预热30min后，调节波长到412nm，用蒸馏水调零。

2.试剂一在25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)预热30min。

3.空白管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL试剂二，20μL试剂三，160μL试剂一，迅速混匀后于412nm测定10s时的吸光度，37℃水浴5min迅速拿出测量412nm下的吸光度记为A1和A2。计算ΔA空白管=A2-A1。

4.测定管：取微量玻璃比色皿或96孔板，加入20μL试剂二，20μL试剂三，140μL试剂一，20μL上清液，迅速混匀后于412nm测定10s时的吸光度，37℃水浴5min迅速拿出测量412nm下的吸光度，记为A3和A4。ΔA测定管=A4-A3。

三、TrxR活性计算

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。

TrxR(U/mg prot)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d) ×10⁹×V反总÷(Cpr×V样)÷T=147×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样本每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。

TrxR(U/g质量)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d) ×10⁹×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T=147×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。

TrxR(U/10⁴cell)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×10⁹×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T= 147×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷细胞数量

ε：TNB在412nm处的摩尔消光系数，1.36×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/ml)，需要另外测定；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02ml；V样总：提取液体积，1ml；T：反应时间，5min；细胞数量：以104为单位，万个；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每毫克蛋白每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。

TrxR(U/mg prot)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d) ×10⁹×V反总÷(Cpr×V样)÷T=245×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每克样本每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。

TrxR(U/g质量)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d) ×10⁹×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T=245×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义：在25℃或者37℃中，每104个细胞每分钟生成1nmol TNB为一个酶活力单位。

TrxR(U/10⁴ cell)=(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×10⁹×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T = 245×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷细胞数量

ε：TNB在412nm处的摩尔消光系数，1.36 ×10⁴L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/ml)，需要另外测定；W ：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02ml；V样总：提取液体积，1ml；T：反应时间，5min；细胞数量：以104为单位，万个；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

注意事项：

1.哺乳动物组织及血液制品TrxR活力测定时，一般须用蒸馏水稀释5倍左右；测定过程操作须迅速。

2.由于试剂一中含有一定浓度的蛋白(约0.1mg/ml)，所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。