正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中 MDH 是 TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH  在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH 分为 NAD-依赖的 MDH 和 NADP-依赖的 MDH， NADP-MDH 主要存在于真核细胞中。

测定原理：

NADP-MDH 催化 NADPH 还原草酰乙酸生成苹果酸，导致 340nm 处光吸收下降。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一、提取液 100 mL×1 瓶，在 4℃保存；

试剂二、液体 20 mL×1 瓶，在 4℃保存；

试剂三、粉剂×1 瓶，-20℃保存；

样本测定的准备：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴ 个)：试剂一体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次)；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 试剂一)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清(浆)样品：直接检测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、检测工作液的配制：用时在试剂三中加入 19mL 试剂二和 0.5mL 蒸馏水，充分混匀待用； 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

3、测定前将检测工作液在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 样本和 195μL 工作液，混匀后立即记录 340nm处 20s 时的吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

注意：若 A1-A2 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，使 A1-A2 小于 0.5，可提高检测灵敏度。

计算公式中乘以相应稀释倍数。

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)NADP-MDH 活力的计算

单位的定义：每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样÷T=6430×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 NADP-MDH 活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/g  鲜重)=[ΔA×V  反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W  ×V  样÷V  样总)÷T=6430×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样÷V 样总×500)÷T=12.86×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.005 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500 万。

1、血清(浆)NADP-MDH 活力的计算

单位的定义：每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样÷T=12860×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 NADP-MDH 活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH(nmol/min/g  鲜重)=[ΔA×V  反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×  V  样÷V  样总)÷T=12860×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-MDH(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=25.72×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.005 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL； T：反应时间，1  min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500 万。