作者将N末端的人RNase H1蛋白通过表面修饰的方法固定在原子力显微镜针尖上。这种蛋白可以结合RNA/DNA杂交双链，称为杂交结合域（hybrid binding domain, HBD），在这里作者使用结构更稳定的DNA探针而不是RNA来检测mRNA。在实验中，修饰后的探针用于检测一种脑特异性miRNA，miR-134。这是一种能够调节脊椎生长和树突生成的脑特异性miRNA。

为了验证特异性的识别，作者首先将全部RNA从细胞中提取出来，并将其与固定在玻璃片上面积大约15-20平方微米的探针DNA斑点杂交。使用布鲁克ForceRobot原子力显微镜²进行单分子力曲线测试，实验结果发现粘附力大约在20pN上下，解离距离大约3.8nm。通过对比修饰后探针与单链ssDNA，双链dsDNA和双链dsRNA斑点以及经过RNase H处理后的斑点间的力曲线，可以确认这是一种特异性结合。在实验中，可以发现当AFM扫描像素点尺寸在4nm时，miR134的粘附力图为一个由34个像素点组成的团簇，并且在大多数像素点上观察到特异性结合的概率不低于40%。这一团簇可以被拟合为一个椭圆，等效圆半径14nm。这一尺寸与结合构型中的分子尺寸一致。通过是否产生粘附力团簇、特异性结合产生的概率即可判断原子力显微镜探针是否检测到了目标mRNA分子。

根据估计，单个miRNA种类在细胞中的平均拷贝数约为500。为了确保能在单个细胞中识别目标miRNA，作者使用FluidFM探针³制备了直径为3-8 μ m的探针DNA斑点，通过将合成miR-134溶液（10-100 aM，40 μL中含有240-2400个拷贝）孵育在其中一个斑点上来评估识别效率。作者在每一个样品的每一个斑点中的三个任意位置记录粘附力数据并取平均值，计算了每个斑点上识别到的miR-134数目。通过线性回归，作者计算出DNA斑点上miR-134的识别效率为78%。

在验证了这一方法可以成功识别体外RNA后，作者进一步将这一方法应用于单个海马体神经细胞上。使用进行修饰后可以与miR-134互补的原子力显微镜探针，作者在神经元体的随机位置进行了力曲线测试。作者使用布鲁克NanoWizard原子力显微镜⁴对MAP2免疫染色标记的神经元在AC模式下进行成像，并选择了三个位置进行粘附力测试（100×100像素，1.0×1.0 μm2），在同一位置得到细胞荧光图像、原子力显微镜图像与力曲线数据（图4）。在神经元体上，每个图像中可以观察到2-4个团簇。RNase H处理后同一区域中团簇的消失，这同样证实了观察到的粘附力曲线是具有特异性的。在固定的神经元上，只有当探针DNA与目标RNA杂交时才观察到合格的簇，而当互补RNA或乱序DNA杂交时则不会观察到团簇，这与在玻璃片上DNA探针斑点上获得的结果一致，即这一miRNA/DNA杂交是特异性检测。

为了进一步验证这种方法的准确性与特异性，作者还分析了在固定的神经元上膜去极化诱导的miR-134表达变化。在固定前，海马神经元（DIV7）通过KCl（40 mM）处理2小时以诱导去极化。在受刺激的神经元（1.0×1.0 μm2）的区域内平均观察到了9.9个团簇，而在未受刺激的对照神经元中仅检测到了2.7个簇（见图5）。使用共聚焦显微镜观察c-Fos的表达增加，进一步验证了KCl刺激神经元的效果。虽然需要进一步研究了解AFM探针的压入深度和样品制备的影响，但这种直接的AFM粘附力图像观察到的簇数增加与在DNA探针斑点上通过提取出RNA进行宏观评估的结果一致。同一细胞上不同位置和同一条见下不同细胞间miR-134数量变化很小，证明了其在DIV7海马体神经元内是全局性表达的。

作者通过建立了一种基于原子力显微镜的粘附力成像新型miRNA定量方法。这种方法的灵敏度足以在单个细胞中分析特定miRNA的拷贝数，而无需修饰、逆转录或扩增。同时可以实现单个miRNA的原位测试。结合AFM的高分辨率特性，这种方法同样适用于神经元的其他区域，如树突和突触。如果借助快速原子力显微镜，将能够高效地可视化单个细胞的整个表面。此外，使用固定细胞和组织的切片能够检查细胞的内部和特定的细胞亚结构。这种新的分析方法为理解miRNA的生物学作用及其细胞间变异提供了新的途径。在生物样品中检测少量的miRNA生物标志物将使得这种方法能够作为一种可行的癌症诊断工具。