蛋白质-蛋白质相互作用在细胞内信号传导、基因调控、代谢途径等生物学过程中至关重要。酵母双杂交技术通过利用酵母细胞作为模型系统，为研究蛋白质间相互作用提供了有效的工具。自从Fields和Song于1989年首次提出这一方法以来，酵母双杂交技术已成为研究蛋白质相互作用网络的重要手段。

酵母双杂交技术基于转录因子的模块化结构，该技术将目标蛋白质分为诱饵蛋白（bait）和猎物蛋白（prey），分别与DNA结合域（DNA-binding domain, BD）和转录激活域（Activation domain, AD）融合。当诱饵蛋白与猎物蛋白在酵母细胞核内发生相互作用时，BD和AD被拉近，形成一个功能性转录因子，激活报告基因的表达。这种报告基因的表达可以通过选择性培养基中的筛选标记（如氨基酸缺陷或酶活性）来检测。

酵母双杂交文库构建

文库构建的重要性

酵母双杂交文库构建是酵母双杂交实验的关键步骤。通过构建一个表达猎物蛋白的cDNA文库，研究人员能够在酵母细胞中表达多种潜在的相互作用伙伴蛋白，以检测与目标诱饵蛋白的相互作用。一个高质量的酵母双杂交文库构建应覆盖感兴趣生物体的广泛转录本，确保在筛选过程中不会遗漏潜在的相互作用。

文库构建的方法

酵母双杂交文库构建通常从感兴趣的组织或细胞类型中提取mRNA，通过逆转录生成cDNA，并将其克隆到带有AD的载体中。常用的载体包括pGADT7等，这些载体具有强启动子以驱动猎物蛋白的表达。文库构建后，载体被转化入酵母细胞，生成一个表达多种猎物蛋白的酵母文库。为了保证文库的质量和多样性，通常需要对文库进行测序和验证。

酵母双杂交文库筛选

筛选步骤

酵母双杂交文库筛选的目的是通过诱饵蛋白筛选出与其发生相互作用的猎物蛋白。筛选步骤包括将含有诱饵蛋白的酵母细胞与酵母双杂交文库中的猎物表达细胞混合培养。阳性克隆的出现表明诱饵蛋白和猎物蛋白之间存在相互作用。阳性克隆可以通过其在选择性培养基上的生长或通过报告基因的表达（如蓝白筛选中的β-半乳糖苷酶活性）来识别。

筛选结果的验证

一旦获得阳性克隆，需要通过进一步的实验验证这些相互作用的真实性。这些验证实验可以包括：

- 重新转化实验：将筛选出的猎物质粒重新转化至含有诱饵的酵母细胞中，以验证相互作用是否可重复。

- 定量β-半乳糖苷酶测定：测量β-半乳糖苷酶活性以定量分析相互作用的强度。

- 体外验证：使用共免疫沉淀或GST pull-down实验在体外验证相互作用蛋白的结合。

酵母双杂交技术的应用

酵母双杂交技术在多个研究领域中具有广泛的应用：

- 蛋白质相互作用网络分析：通过酵母双杂交文库筛选，研究人员可以绘制细胞内的蛋白质相互作用网络图，从而揭示蛋白质功能和信号传导途径。

- 疾病相关蛋白质研究：Y2H技术已用于筛选与癌症、阿尔茨海默症等疾病相关的蛋白质相互作用，这有助于发现潜在的药物靶点。

- 新蛋白质功能的发现：通过酵母双杂交文库筛选，研究人员可以识别未知蛋白质的相互作用伙伴，从而推测其生物学功能。

酵母双杂交技术通过结合酵母双杂交文库构建和文库筛选，为研究蛋白质相互作用提供了强有力的手段。随着技术的不断优化，酵母双杂交在生物学和医学研究中的应用将继续扩大，为揭示生命活动的分子机制提供更深入的理解。

参考文献

1. Fields, S., & Song, O. (1989). A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature, 340(6230), 245-246.

2. Bartel, P. L., Chien, C. T., Sternglanz, R., & Fields, S. (1993). Using the two-hybrid system to detect protein-protein interactions. Cell, 74(1), 73-82.

3. James, P., Halladay, J., & Craig, E. A. (1996). Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics, 144(4), 1425-1436.

4. Suter, B., & Auerbach, D. (2002). Yeast two-hybrid screening of protein-protein interactions in proteome scale. Genomics, 80(5), 559-570.

5. Vidal, M., & Legrain, P. (1999). Yeast forward and reverse ‘n’-hybrid systems. Nucleic Acids Research, 27(4), 919-929.