酪氨酸酶(tyrosinase：EC 1.14.18.1)是一种单酚单加氧酶，是具有双功能的含铜糖蛋白，广泛存在于植物、酵母和动物组织中。酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶，也是引起果蔬酶促褐变的主要因素，同时也对昆虫的免疫及生长有重要影响。

酪氨酸酶催化L-多巴生成多巴色素，其在475nm下有特征吸收峰，进而测定出酪氨酸酶的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂一：临用前每瓶加入15ml提取液充分溶解待用，现配现用。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1.组织：称取约0.1g组织，加入1ml提取液进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

2.细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1ml提取液，超声波破碎细菌或细胞(功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次)。12000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

3.血清(浆)：直接检测。

二、测定操作

1.分光光度计预热30min，波长调至475nm。蒸馏水调零。

2.加样表(在1ml玻璃比色皿中分别加入)

充分混匀后立即测定10s时在475nm下的吸光度，记为A1，之后迅速将其放入37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)水浴或培养箱中3min。然后迅速拿出擦净后测定190s时的吸光度，记为A2。计算ΔA=A2-A1。

三、酪氨酸酶酶活计算

1.按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。

酪氨酸酶(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(V样×Cpr)÷T=90.09×ΔA÷Cpr

2.按样本质量计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。

酪氨酸酶(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(W÷V提取×V样)÷T=90.09×ΔA÷W

3.按细胞或细菌数量计算：

单位的定义：每104个细胞或细菌每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。

酪氨酸酶(U/10⁴cell)=ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(500÷V提取×V样)÷T=0.18×ΔA

4.按血清(浆)体积计算：

单位的定义：每ml血清(浆)每分钟催化生成1nmol多巴色素的酶量定义为一个酶活性单位。

酪氨酸酶(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹÷V样÷T=90.09×ΔA

V反总：反应总体积，10-3L；ε：多巴色素的摩尔消光系数：3.7×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；109：单位换算系数，1mol=109nmol；V样：加入的样本体积，0.1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量， g；V提取：提取液体积，1ml；500：细胞或细菌总数，500万；T：反应时间，3min。

注意事项：

1.当ΔA大于0.3时，建议将样本用提取液稀释后测量；ΔA过小时，建议增加酶促反应时间(5min或10min)或增加加入的样本体积来测定。

2.试剂一溶解后易氧化。溶解后尽快用完。