实验报告：

一、BxPC-3(原位胰腺腺癌细胞)分离与培养：

    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；

    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃箱中孵育细胞过夜；

    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。

细胞特性：

1)组织来源于实验动物的正常眼组织。

2)细胞鉴定：细胞角蛋白-18(CK-18)免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：上皮样，不规则细胞，贴壁培养。

注意事项：

1、观察细胞zui好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，否则不能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X或20X物镜下。

2、瓶中运输培养基不能重复再用,请换用加双抗的新培养基，细胞冻存后,培养基中可不加任何抗生素。

3、有些细胞贴壁不牢，如发现贴壁细胞有脱落，可离心吹打后接种到新瓶内。

4、收到细胞后，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请及时与我们。

DERA (Deoxyribose-phosphate aldolase) ELISA KITMonkey TLR2(Toll-Like Receptor 2) ELISA KitN-叔丁基哌嗪组织一氧化氮合成酶总活性荧光定量检测试剂盒

DEPTOR (DEP domain-containing mTOR-interacting protein) ELISA KITMonkey TNFRSF1A(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily, Member 1A) ELISA KitN-叔丁基哌嗪血液一氧化氮合成酶总活性荧光定量检测试剂盒

DCAKD (Dephospho-CoA kinase domain-containing protein) ELISA KITMonkey TNF-α(Tumor Necrosis Factor Alpha) ELISA Kit1-萘甲腈尿液一氧化氮合成酶总活性荧光定量检测试剂盒

HELQ (Helicase POLQ-like) ELISA KITMonkey TSLP(Thymic Stromal Lymphopoietin) ELISA Kit1-萘甲腈细胞结构型神经元一氧化氮合成酶（cNOS/NOS1/nNOS）活性比色法定量检测试剂盒

PRKDC (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit) ELISA KITMonkey α2-M(Alpha-2 Macroglobulin) ELISA Kit正丁基苯组织结构型神经元一氧化氮合成酶（cNOS/NOS1/nNOS）活性比色法定量检测试剂盒

CYP4F2 (Phylloquinone omega-hydroxylase CYP4F2) ELISA KITMonkey αFP(Alpha-Fetoprotein) ELISA Kit正丁基苯血液结构型神经元一氧化氮合成酶（cNOS/NOS1/nNOS）活性比色法定量检测试剂盒

GAD1(Glutamate decarboxylase 1) ELISA KitMonkey OAS1(2'-5'-oligoadenylate synthetase 1) ELISA KitN-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐体液结构型神经元一氧化氮合成酶（cNOS/NOS1/nNOS）活性比色法定量检测试剂盒

CYTIP (Cytohesin-interacting protein) ELISA KITMonkey COR(Cortisol) ELISA KitN-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐细胞诱导型巨噬细胞一氧化氮合成酶（iNOS /NOS2/mNOS）活性比色法定量检测试剂盒

PLAGL2 ELISA KitHOXB5  同源盒蛋白HOXB5抗体硅酸四乙酯芦荟大黄进口/国产5-HTR2A  5-羟色受体2A抗体含量：HPLC≥98%

PLA2G4B ELISA KitID4  DNA结合抑制因子4抗体多肽试剂 TOTU杨梅进口/国产5-HTT  5-羟色转运蛋白抗体含量：HPLC≥99%

PLA2G4E ELISA KitIGF2R/M6PR/CD222/Mannose 6 Phosphate Receptor  胰岛素样生长因子2受体抗体多肽试剂 TOTU二氢杨梅进口/国产5-HTR3  5-羟色受体3抗体含量：HPLC≥98%

PLA2G4F ELISA KitKCND1/Kv4.1  电压门控钾通道Kv4.1抗体多肽试剂 TOTU阿魏酸进口/国产5-HTR4  5-羟色受体4抗体含量：HPLC≥98%

PON3(Serum paraoxonase/lactonase 3) ELISA KitGIRK1  G蛋白激活内向钾通道1抗体三氯异氰脲酸白藜芦醇进口/国产5 lipoxygenase/ALOX5  5-脂合酶抗体含量：HPLC≥98%

PLAC1L ELISA KitGIRK3/KCNJ9  G蛋白激活内向钾通道3抗体三氯异氰脲酸虎杖苷（白藜芦醇苷）进口/国产Phospho-5-Lipoxygenase(Ser271)  酸化5-脂合酶抗体含量：HPLC≥98%

PLAGL2 ELISA KitKCNK9/KCNK3  酸敏感钾离子通道蛋白3抗体三甘醇单甲醚薄荷醇进口/国产Phospho-5-Lipoxygenase(Ser663)  酸化5-脂合酶抗体含量：HPLC≥98%

PKMYT1 ELISA KitKCNN4  钙激活钾通道蛋白4抗体三甘醇单甲醚丹皮酚进口/国产ALOX12/12 Lipoxygenase  12脂合酶抗体含量：HPLC≥99%

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。