Fluo-4是一种将Fluo-3结构中的Cl替换成F的钙荧光探针。由于将Cl替换成了电子吸引力更强的F，它的最大激发波长会向短波长处偏离10 nm左右。这个波长更接近于氩激光器的波长，所以用氩激光器激发时，Fluo-4的荧光强度比Fluo-3强一倍。

Fluo-4, AM穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-4，从而被滞留在细胞内，Fluo-4若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。

操作说明(for Human T cells)*

(1) 试剂

2 mM的Fluo-4, AM/DMSO(将1mg Fluo-4, AM溶于442μL DMSO)

Pluronic F127

Hanks?balanced salt solution(HBSS)

HEPES buffer saline(10mM HEPES，1mM Na2HPO4，137mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，5mM glucose，0.1% BSA，pH 7.4)

(2) 操作

①. 向Fluo-4, AM/DMSO溶液中加入16.5mg Pluronic F127，Pluronic F127可以 防止Fluo-4, AM在HBSS中聚合并能帮助其进入细胞。

②. 用HBSS稀释Fluo-4, AM溶液，制备4μM的Fluo-4, AM工作液。

③. 将Fluo-4, AM工作液加入细胞，在37℃培养20分钟。

④. 加入5倍体积的含有1%胎牛血清的HBSS，再继续培养40分钟。

⑤. 用HEPES buffer saline洗涤细胞3次，然后用HEPES buffer saline使细胞重悬浮，制成1×105 cells/mL的溶液。

⑥. 37℃下培养10分钟，然后用该细胞进行荧光钙离子检测。激发波长494nm，发射波长516nm。

*标记的条件因细胞种类而异，在每次实验前，请先确定最佳条件。以上方法仅供参考。

储存条件：-20℃干燥避光保存，有效期一年。