PAK4丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PAK4ELISA试剂盒实验操作步骤

** 标准品稀释与加样**

取出标准品，按照说明书要求用样本稀释液进行梯度稀释（建议设置6-8个浓度梯度）。将稀释后的标准品分别加入酶标板孔中，每孔100μL，避免产生气泡。同时设置空白孔（仅加稀释液）和样本孔（待测样本同样加100μL），每个浓度及样本需做复孔。

** 孵育与洗涤**

加样完成后，用封板膜密封酶标板，置于37℃恒温孵育箱中孵育90分钟。孵育结束后，弃去孔内液体，在吸水纸上拍干。每孔加入300μL洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤3次。最后一次洗涤后彻底拍干板内残留液体，避免交叉污染。

** 酶标抗体结合**

每孔加入100μL HRP标记的检测抗体（工作液浓度需预实验优化），再次密封酶标板，37℃孵育60分钟。重复步骤7的洗涤操作，确保未结合的抗体被完全去除。

**显色与终止反应**

洗涤完成后，每孔加入90μL TMB显色底物，避光室温孵育15-20分钟（或观察到标准品孔出现明显蓝色梯度）。随后每孔加入50μL终止液（2M硫酸），轻轻震荡混匀，溶液由蓝转黄，此时应立即用酶标仪检测。

** 数据读取与分析**

使用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值（空白孔调零），记录数据并绘制标准曲线（横坐标为标准品浓度，纵坐标为OD值）。通过曲线方程计算待测样本中PAK4的浓度，注意复孔间差异应小于10%。若样本OD值超出标准曲线范围，需稀释后重新检测。

**注意事项**

- 全程避免酶标板长时间暴露于强光或高温环境。

- 加样时枪头避免接触孔内液体，防止交叉污染。

- 若样本为细胞裂解液，需离心去除沉淀，确保上清液澄清。

- 实验结束后，未使用的试剂需按说明书要求保存（如HRP抗体需-20℃避光储存）。